澳门新葡3522最新网站林双君团队ACS Catalysis上发文:“一锅酶法”制备氟苯尼考合成的最直接手性中间体
发布时间 :2021-06-11  阅读次数 :123

近日,国际知名期刊《ACS Catalysis》在线发表了澳门新葡3522最新网站林双君团队的研究成果“One-Pot Asymmetric Synthesis of an Aminodiol Intermediate of Florfenicol Using Engineered Transketolase and Transaminase”。林双君教授为通讯作者,澳门新葡3522最新网站研究生刘琦为第一作者。

在对转酮酶和转氨酶催化机制和蛋白结构认识基础上,利用分子对接手段建立了酶-底物结合模型,并基于此设计半理性突变策略,翻转了转酮酶的立体选择性,转氨酶的对映偏好性和醛酮选择性,进而偶联转酮酶和转氨酶突变体一锅法合成了末端羟基手性中间体(1R,2R)-对甲磺砜基苯丝氨醇,产率可以达到76%,非对映体选择性最高为96% de 和对映体选择性> 99% ee,为氟苯尼考的制备提供了最直接的手性中间体。

   基于设计研究者从一系列转酮酶和转氨酶中筛选出能有效催化起始底物醛1的转酮酶突变体EcTK1和有效催化转酮酶产物2氨基化的ω-转氨酶ATA117。为了考察转酮酶的立体选择性,建立了一个通过非手性液相测定2立体构型的方法,即偶联一个对2基本无立体选择性的R-转氨酶突变体ATA117_AC,将(S)-和(R)-2分别转化成(1S,2R)-和(1R,2R)-3。从而可以确定EcTK1是S-选择性的,催化产生的羟酮中间体为S-构型(93.3% ee(如图1所示)。由于所设计的路线是合成R-羟酮中间体,因此基于转酮酶的蛋白质结构和催化机制对该酶作了半理性改造。首先将底物醛1对接进EcTK1晶体结构的活性口袋中 (如图2A所示),发现醛羰基与H26和H261存在氢键相互作用,而F434位于醛羰基的背面。因此提出一个假设,如果通过氨基酸突变改变醛羰基的定位,那么很有可能会改变羟酮产物的立体构型。为了翻转醛羰基的朝向,采用了“破而后立”的策略,即先打破现有的氢键相互作用,而后建立新的氢键相互作用。通过迭代的饱和突变和理性突变,获得了立体选择性完全翻转的EcTK1_YYF和EcTK1_YYH突变体,ee(R)分别为91.6%和95.2% (如图1所示)。通过将突变体EcTK1_YYH底物醛1进行分子对接,证实了醛羰基的朝向的确发生了翻转,与背面的Y434形成了新的氢键(如图2B所示)。

图1. 转酮酶EcTK1的蛋白质进化

图2. 转酮酶EcTK1 (A)和EcTK1_YYH (B)与醛1的分子对接

图3. 转氨酶ATA117的蛋白质进化

在实现转酮酶的立体选择性翻转后,作者基于R-2底物与ATA117_AC的分子对接,对转氨酶作了迭代饱和突变,筛选所得突变体ATA117_ACHH翻转了对手性羟酮中间体2的对映偏好性和醛酮底物选择性,即从野生型ATA117对S-酮的偏好性(Es=8.5)翻转为突变体ATA117_ACHH对R-酮的偏好性(ER=11.7) (如图3所示);从野生型ATA117对醛的偏好性翻转为突变体ATA117_ACHH对酮的偏好性。为了考察ATA117_ACHH对R-酮的偏好性,分别作了ATA117_ACHH与-S2bR-2a的分子动力学模拟,证实氨基供体PMP的氨基R-酮的羰基距离在3.5Å左右,而S-酮羰基距离为10-30Å (如图4所示)

图4. 分子动力学数据的统计

在获得了合适的转酮酶和转氨酶突变体之后,两个酶偶联一锅反应合成了目标产物氟苯尼考手性中间体(1R,2R)-对甲磺砜基苯丝氨醇,产率为76%,非对映选择性为96% de和对映选择性> 99% ee,并且进一步将该级联反应拓展到其他一系列对位取代的苯甲醛,合成了相应的(1R,2R)-对位取代的苯丝氨醇衍生物,产率为51-80%de为95-97%。

该研究工作得到了国家重点研发计划项目(2018YFA0901900)和国家自然科学基金项目(21632007,31425001)的资助。

全文链接为:https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acscatal.1c01229